SDS-PAGE: 原理、プロトコールなど

このページの最終更新日: 2024/07/22

概要と原理
プロトコール
トラブルシューティング

概要と原理

SDS-PAGE とは、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS; sodium dodecyl sulfate) およびポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE; polyacrylamide gel electrophoresis) を用いて、タンパク質 protein を分子量によって分画する手法である。

CH₃-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-SO₂-ONa

SDS の構造 (Public domain)

以下の 2 点が SDS-PAGE の原理のポイントである。

常に負の電荷をもつ DNA と異なり、タンパク質の電荷はその種類や溶媒の pH などによって変化する。電気泳動を行うには、何らかの方法でタンパク質全体の電荷を揃える必要がある。SDS-PAGE では、SDS がタンパク質に結合して負電荷を与える。
また、タンパク質はさまざまな高次構造をとる。電気泳動では、ゲルの網目を流れる際の抵抗によってタンパク質をわけるので、分子量が同じでも、球状のタンパク質は早く泳動され、長い紐状のタンパク質はゆっくりと泳動される。そのため、電荷だけでなく高次構造を揃える必要がある。SDS-PAGE では、SDS でタンパク質を変性させ、さらに β-メルカプトエタノールでシステイン cysteine 同士のジスルフィド結合を還元することで、タンパク質を直鎖状にしている。

タンパク質に結合する SDS の量は、ほぼ全てのケースで分子量に比例する (2)。これによって、タンパク質を分子量に応じて分画することが可能になっている。ただし、荷電アミノ酸が多量に含まれていたり、タンパク質がリン酸化などの修飾を受けている場合には、移動度は必ずしも分子量通りにはならない (2)。

> およそ 2 アミノ酸ごとに 1 分子の SDS が結合する (2)。

1 g のポリペプチドに対して、1.4 g の SDS が結合しているという計算になる。

プロトコール

概要

以下、SDS-PAGE の手順を順番に解説する。

ゲルの作成
電気泳動
ゲルの染色

ゲルの作成

最近では既製品のプレキャストゲルを買うのも一般的だが、自分でゲルを作るときには以下の試薬を用いる。

30% アクリルアミド溶液	アクリルアミドは、ゲルの網目構造を作り出す物質である。 30% アクリルアミド溶液と書かれることがあるが、実際は w/v で 29% のアクリルアミドと 1% の N,N'-bis-アクリルアミドを含む混合液が使われる。これらの濃度は、製品によって異なることがある (2)。アクリルアミドだけだと直鎖状のポリマーになるが、N,N'-bis-アクリルアミドを加えることで 3 次元の網目構造が作られる。 N,N'-bis-アクリルアミドの割合が高いと、ゲルの pore size が小さくなる。下にあるゲルの濃度とタンパク質量の関係を示した表は 29 : 1 の場合であり (2)、製品によっては再検討が必要である。 15% アクリルアミドゲル: 10 - 43 kDa 12% アクリルアミドゲル: 12 - 60 kDa 10% アクリルアミドゲル: 20 - 80 kDa 7.5% アクリルアミドゲル: 36 - 94 kDa 5.0% アクリルアミドゲル: 57 - 212 kDa
Tris buffer (1.5 M, pH 8.8)	Resolving gel (separating gel) に使う緩衝液。
Tris buffer (1 M, pH 6.8)	Stacking gel に使うバッファー。 SDS-PAGE ゲルには stacking gel と resolving gel がある。Stacking gel の役割は以下の通り (2)。 pH 6.8 では、泳動バッファー (Tris-HCl, pH 8.3, glycine) に含まれるグリシンの解離度が低く、Cl^- よりも遅く泳動される。したがって、電圧をかけると Cl^- は泳動の先端に、グリシンは泳動の後端に位置する。イオンが先端および後端に集中するので、その間の領域は電流が流れにくい low conductivity の領域になる。つまり抵抗の大きい領域である。この領域には、たくさんの電圧がかかることになる。オームの法則 E = IR で、I はひと続きのゲルなので一定、R が大きいので必然的に E が大きくなる。 SDS と結合したタンパク質の泳動速度は両者の中間であり、この電圧が高い領域に存在する。高電圧なので早く泳動されるが、先行する Cl^- に近づくと電圧が下がるので遅くなる。後方からグリシンが近づいてくると、電圧も上がって泳動が早くなる。結果として狭い領域に stack される。これによって、タンパク質は濃縮されて同時に resolving gel に入る。つまり stacking gel を使うことで解像度が大きく上がる。グリシンが pH 8.8 の resolving gel に到達すると、泳動速度は早くなり、ポリペプチドを追い越す。この過程で、ポリペプチドはさらに stack される。
過硫酸アンモニウム: APS	フリーラジカルを発生し、アクリルアミドの重合を促進する。蒸留水で 10% 溶液を作りストックしておく。1 - 2 週ごとに新しいものを使用する (2)。
TEMED	N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine。APS によって作られたフリーラジカルを安定化する試薬。重合を促進する。APS, TEMED ともに重合促進剤と考えるのが妥当である (3)。

具体的なプロトコールは、とりあえず以下のサイトを参照。

SDS ポリアクリルアミドゲルの作製方法。テフコ Pdf file.
日本蛋白質化学会のページ、pdf.

電気泳動

必要な試薬は、基本的に泳動バッファーと 2x Laemmli buffer のみ。

泳動バッファー

以下の組成の Tris-Glycine buffer が一般に使われる。10x バッファーが市販されているが、簡単なので作った方が安いだろう。作る際には、とくに pH を合わせる必要はない。

25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS.

Cold Spring Harber プロトコールでは、10 x 溶液を 1 L 作る場合、30.0 g of Tris base, 144.0 g of glycine, and 10.0 g of SDS in 1000 ml of H2O と書かれている。pH は自動的に 8.3 ぐらいになり、調整不要。室温で保存し、1 x を実験に使う。

2x Laemmli バッファー

4% SDS, 20% グリセロール, 10% 2-メルカプトエタノール, 0.004% bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH 6.8 (Sigma の製品ページ).

サンプルと 1 : 1 の割合で混ぜ、沸騰水中で 3 - 5 分ほど変性させてからゲルにアプライする。

一般に stacking gel 中は低電流で泳動し、separating gel に入ったら電流を上げる。私が習ったのは、15 mA - 30 mA ぐらいが普通で、25 mA - 50 mA ぐらいまでなら問題ないという方法だった。

SDS-PAGE の泳動段階でよく議論されるのは、定電流にすべきか、定電圧にすべきか という点である (4)。

ここで考えるべきポイントは、以下の 3 点である。

オームの法則 V = IR (電圧 = 電流 x 抵抗)
電気泳動が進むと、ゲル中の塩化物イオン Cl^- が緩衝液中のグリシンやトリシンに置換される。塩化物イオンは導電率が高く、ゲル中を高速で移動するためである (4)。
そのため、電気泳動中は抵抗が徐々に上昇する。
電気泳動による発熱は、原則としてワット数 (電流 x 電圧) が高いほど大きくなる。

定電圧モードでは、抵抗が上昇すると電流は減少する。したがって、電気泳動が進むにつれてワット数が減少し、発熱も小さくなる。泳動時間は、定電流モードよりも長くなる。

定電流モードでは、抵抗が上昇すると電圧も上昇する。同じ電流を保つためである。したがってワット数も大きくなり、ゲルが発熱する。また、接触不良などによって局所的に抵抗が大きくなっても、発熱が起こる。

ゆえに、定電流モードを使うときは、電圧の最大値を設定しておくのが安全である。

トラブルシューティング

ゲルのスマイリング、酸性サンプルなどにみられる泳動の歪みなど。更新予定。

References

ページ編集の際に削除
Green and Sambrook, 2012a. Molecular cloning: A laboratory manual, 4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

分子生物学関係のプロトコール集では、この本よりも有名なものはないだろう。

日本語版がない、電子書籍版もない、値段が高い、重い (3 冊組でとどく) など問題点は多々あるが、それでも実験室に必ずあるべき書。ラボプロトコールをまとめたりする時間を大いに節約することができる。

このサイトにあるプロトコールも、多くはこの本の記述を参考にしたものである。

効率の上がる核酸実験法第3回変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (III). 実験医学.
Thermofisher タンパク質電気泳動における電力の設定. Link: Last access 2019/05/29.

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