PCR: 目次,原理およびトラブルシューティング

experiments/dna/pcr
5-26-2017 updated


  1. 概要:PCR の原理
  2. トラブルシューティング
    • PCR が増えない
    • 非特異的産物が多い

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PCR の原理と関連ページへの目次


トラブルシューティング

PCR が増えない

電気泳動 して期待通りに増幅産物が得られなかった場合,positive control を真面目に作っていれば,かなりの程度で問題点を特定できる。まず,問題点が試料の PCR であることを以下のようにして特定する。


  1. 電気泳動のマーカーは見えるか? 見えるなら電気泳動自体は OK。
  2. ポジティブコントロールは増えているか? 増えているなら酵素や PCR の機械は OK。試薬の入れ忘れもこれでチェックできる。
    • まれに PCR の特定の穴が正確な温度変化をしない場合がある。どの位置のサンプルが増えないかも記録しておこう。
  3. 1 と 2 が OK な場合,試料の PCR に問題があることになる。

プライマーダイマーが多量にある場合

Primer dimer は,最初の熱変性ステップが始まる前にプライマー同士がアニールし伸長することで生じる (1)。したがって,primer dimer が見える場合には primer とテンプレートの結合が十分でない可能性がある。以下のような対処法がある。

  • ホットスタートを行う ことでプライマーが適切に増幅に使われ,望んだ PCR 産物を得られる可能性がある。
  • Primer の濃度が高すぎる可能性がある。濃度を下げる。
  • アニーリング温度を下げる。

全く何も見えない場合

酵素,DNA などの入れ忘れを疑う。ポジティブコントロールを作っていれば DNA またはプライマーの入れ忘れをチェックすれば良い。

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References

  1. Roche マニュアル. PCR の一般的なガイドライン. Pdf file.

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