リアルタイムPCR: 原理、プロトコール、データ解析など

experiments/rna/real-time
2018/05/03 更新


  1. 原理
  2. プライマーの設計
  3. 絶対定量と相対定量
  4. 融解曲線分析
  5. データ解析
  6. 図の書き方: Y 軸に何をプロットすべきか
  7. Tips

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原理

まだ編集中ですが、アップしておきます。

> cDNA は希釈すべきか? という Thermo FIsher の Youtube
  • PCR 阻害物質 の持ち込みを気にしているなら、問題にならないことが多い。逆転写の阻害の方が起こりやすい。cDNA を希釈するよりは、RNA をきれいにしておくべき。
  • ただし、逆転写 buffer の多量の持ち込みはリアルタイム PCR を阻害する。リアルタイム mixture の 20% 以上 cDNA を入れないこと (ただし、20% はかなりの量)。
  • 18S のような高発現の内部標準遺伝子の立ち上がりが早すぎて、threshold line がうまく引けなくなることがある。これは希釈するよい理由だが、ターゲット遺伝子の Ct が大きくなりすぎないように注意する必要がある。

融解曲線分析

SYBR でリアルタイム PCR を行う場合には、目的の産物のみが増幅されていることを確認する必要がある。融解曲線分析 dissociation curve analysis or melting curve analysis はそのための方法で、PCR のあとに一定のプログラムを走らせることで行う。なお、増幅産物の電気泳動も有効である。


図の書き方: Y 軸に何をプロットすべきか

Comparative Ct 法では、RNA 量の相対値のみが得られる。内部標準遺伝子 に対する相対値で表示する方法 (つまり、2-dCt をプロットする) と、特定のサンプルに対する相対値で表示する場合があり、後者の方が一般的なようである。

2-dCt をプロットする

文献 1 に例があるので、図を引用する。縦軸の値が β- actin に対する相対量で示されており、ゆえに小さな値になる。

こっこで MIN6 を 1 として軸を書き換えると、次の項目にある「サンプル間の相対値で示す」方法になる。2-dCt をプロットする方が情報量が多くて良いと思うのだが、多くの論文はこの方法を使っていない。


Legend 抜粋 (1)

Comparison of the Expression of T1Rs and Gustducin in Islets and MIN6 cells. mRNA levels for T1R2, T1R3 and Gagust were measured by quantitative PCR in islets and MIN6 cells and expressed as relative to beta actin.


サンプル間の相対値で示す

例になる図がみつかったら追加する。


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References

  1. Nakagawa et al. 2009a. Sweet taste receptor expressed in pancreatic b-cells activates the calcium and cyclic AMP signaling systems and stimulates insulin secretion. PLoS ONE 4, e5106.
  2. Bartelt et al. 2011a. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med 2, 200-206.
  3. Livak and Schmittgen 2001a. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ddct method. Methods 25, 402-408.
  4. Schmittgen and Livak 2008a. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc 3, 1101-1108.

Nakagawa et al. (2009a) is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Also see 学術雑誌の著作権に対する姿勢.