エタノール沈殿 (エタ沈): 原理、プロトコールなど

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7-17-2017 updated


  1. 原理
  2. DNA のエタ沈に影響する要因
    • 沈殿させる時間と温度
    • DNA 濃度
    • 遠心分離の時間
    • 溶液量
  3. DNA のエタ沈に使われる塩の種類と特徴
  4. エタノール沈殿によるタンパク質の精製

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原理

エタノール沈殿の原理は コロイドの塩析 である。

DNA のエタ沈を例にして説明する。DNA は負に荷電しており、水溶液中では 水分子 と水和した状態で「親水性コロイドとして水にとけている」。ここに エタノール を加えると、DNA と水の結合が阻害され、DNA が析出してくる (1)。

なお、塩を加えて DNA の負電荷が作り出す反発を和らげることで、DNA がより凝集しやすくなる。このため、エタ沈実験では溶液に塩を加えることが多い (1)。

PEG のページ に PEG 沈の特徴とプロトコールに関する記載があります。


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DNA のエタ沈に影響する要因

温度

収量を上げるため -70°C で 30 分冷却するというプロトコールがあるが、これは逆効果で、かえって回収率が落ちる (1)。

ただし、DNA が低濃度の場合、エタノールと塩を加えた後に時間をおくこと自体は有効である (1)。短い DNA なら、4°C とかで一晩置くのが良いのだろうか。


DNA 濃度

基本的に 濃い溶液の方が回収率が高い (1)。

  • 2.4 ng/ml - 0.4 µg/ml の範囲では、回収率にほとんど差がない (1)。
  • 4 µg/ml では回収率が上昇し、40 µg/ml でほぼ 100% になる (1)。

遠心分離の時間

基本的に 長い方がよい (1)。とくに DNA 濃度が低い場合には、5 分の遠心で回収率は 25% 程度だが、30 分遠心すると 80% になる。

DNA 濃度が高い場合には、短い時間の遠心で十分な回収率が得られる。20 - 30 分で回収率は飽和に近くなる。


溶液量

基本的に 少ない方がよい (1)。これは単純に、凝集した DNA がチューブの底に到達する時間が短くなるため。


DNA のエタ沈に使われる塩の種類と特徴

酢酸ナトリウム
Sodium acetate

3M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) を溶液の 1/10 量加えるというのが、最も一般的なエタ沈のプロトコールである。つまり終濃度は 0.3 M ということになる。

酢酸アンモニウム
Ammonium acetate

dNTP, 糖類, タンパク質 の共沈が少なくなるという特徴がある (1)。

ただし アンモニウムイオンは以下の反応を阻害する (1) ので、以降の実験によっては酢酸アンモニウムを用いることができない。

  • T4 ポリヌクレオチドキナーゼ
  • DNA ligase (つまり ligation の前には使えない)
  • いくつかの 制限酵素

塩化リチウム
Lithium chloride

DNA は「デオキシ」リボヌクレアーゼであり、RNA よりも一つ分子内の水酸基 -OH が少ない。よって水溶性が高く、DNA より多くのエタノールを必要とする。

塩化リチウムは 他の塩よりもエタノールへの溶解性が高く、共沈しないという特徴をもっている。そのため RNA のエタ沈に使われる (1)。

ただし、塩化物イオンは逆転写を阻害するため、この場合にはリンスで十分に塩を除去する必要がある。

塩化ナトリウム
Sodium chloride

DNA 溶液に SDS が含まれている場合、SDS の析出を防ぐために終濃度 0.2 M で塩化ナトリウムを使用する必要がある (1)。

これは、SDS のナトリウム塩は溶解度が高いが、その他の塩の溶解度が低いということである。とくにカリウム塩は難溶性である (1)。アルカリ法によるプラスミド精製 では、あえて酢酸カリウムを使うことで SDS を析出させ、取り除くステップがある。

塩化マグネシウム
Magnesium chloride

他の塩よりも強力で、短い DNA 溶液も沈殿させられる。0.01 M Mg Cl2, 50% EtOH で、7 塩基以上の核酸を沈殿させることができるらしい (1)。


エタノール沈殿によるタンパク質の精製

タンパク質 は、種類によって溶解度が異なっている。つまり、エタノールを一定量加えたときに、一部のタンパク質は沈殿し、その他は沈殿しないという現象がおこる。これを利用して、エタノール沈殿でタンパク質を精製する方法がある。

ただし、これはラフな分画 (粗精製) であり、カラムクロマトグラフィーなどを利用した方がもちろん得られるタンパク質の純度は高くなる。

組織から抽出したタンパク質溶液から、まず不要なタンパク質をエタノール沈殿や硫安沈殿などで取り除き、クロマトグラフィーなどでさらに精製するというのが一般的な手法である。


> パイナップルの酵素 ブロメライン をエタ沈で簡単に精製した論文 (2)。

  • 一般に、水にエタノールを添加すると温度が上がる。タンパク質への影響を抑えるため、ゆっくり入れる。
  • パイナップルの茎と皮をから、蒸留水とミキサーで抽出。これに徐々にエタノールを加えていく。
  • 70% (v/v) EtOH 添加後、bromelain の 99.7% (活性ベースで) が沈殿した。
  • 凍結乾燥しても、10% グルコースを溶媒に加えておけば 90% 程度活性が維持された。
  • 280 nm で励起すると、345 nm の蛍光が観察される。これに関わるのは、活性中心にある Tyr。
  • 凍結乾燥後にも、標品と同様 345 nm の蛍光がみられた。よって Tyr 周辺の構造は破壊されていない。
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References

  1. 春木 2011a. エタノール沈殿あれこれ. 生物工学 89, 254-256.
  2. Soares et al. 2012a. Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation. Sep Purif Technol 98, 389-395.

このページの大部分は Reference 1 の日本語総説を参考に書かれていますが、Reference 1 を見てみると、非常に多くの部分が Molecular Cloning からの内容です。このバイブルをぜひ 1 冊。生物お勧め参考書・実験の本 のページも参照して下さい。