プラスミドの精製: アルカリ法

experiments/dna/plasmid_purification
10-7-2017 updated


  1. 原理
  2. プロトコール

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アルカリ法の原理

プラスミド plasmid は,原核生物 prokaryotes染色体 以外に存在する DNA である (3)。次のような特徴をもっている。

  • 大きさは 1 kb から 200 kb と様々。ほとんどは二本鎖の環状 DNA である。
  • 自然界に存在するプラスミドは,多くの場合近縁種でしか維持されない。
  • プラスミドの分裂および遺伝様式は,染色体のそれとは独立している。
  • 一般に,宿主に有利な形質を提供するような遺伝子を含んでいる。抗生物質への耐性,複雑な化合物を分解する能力など。

アルカリおよび SDS を用いたプラスミドの抽出法のオリジナルは,Birnboim and Doly 1979 であるらしい (3)。原理の概要は以下の通り。

  1. プラスミドを含むバクテリアを高 pH 条件で aniotic detergent に晒すことで細胞壁を破壊し,かつ染色体の DNA を結合タンパク質とともに変性させる。pH が高いので DNA は 1 本鎖に分かれるが,プラスミド DNA は複雑に絡まった構造をしているために分離しない。
  2. バクテリアのタンパク質,細胞壁および染色体 DNA は,溶解の過程で SDS にコートされた複合体を形成する。Na+ を K+ で置換すると,この複合体が沈殿する。
  3. 沈殿物を遠心分離で除き,上清に含まれるプラスミドを回収する。

SDS の水への溶解度は,20°C でおよそ 150 g/L である (4)。一方,カリウム塩 potassium lauryl sulfate は 25°C でわずか 450 mg/L で (5),この溶解度の違いが本法のキモである。

キットを用いた抽出が主流である。各社のプラスミド抽出キットの比較 ページも参照のこと。


プロトコール

必要な試薬

Solution I, II, III の組成は以下の通り。Sigma Aldrich のオンライン資料 (2) と Molecular Cloning (Amazon) に同じ組成が載っており,非常に一般的な組成と思われる。


Solution I

50 mM Glucose
25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
10 mM EDTA

  • 調製後に 15 min, 15 psi でオートクレーブ。4 °C で保存。

Solution II

0.2 N NaOH
1% SDS (w/v)

  • 滅菌はしない。常温保存。
  • 数週間は保つが,空気中の二酸化炭素と反応して次第に劣化するので注意。

Solution III

5 M 酢酸カリウム溶液 60 mL,酢酸 11.5 mL,純水 28.5 mL を混合する。

  • 粉の酢酸カリウムを用いる場合は,29.5 g の酢酸カリウムを純水で 100 mL にメスアップする。終濃度はカリウム 3 M,酢酸 5 M である。4°C 保存。
  • SDS を沈殿させるために高濃度のカリウムが,plasmid を 2 本鎖に戻すために酢酸が含まれている。

プロトコール

  1. Solution III を氷上で冷やす。
  2. 大腸菌培養液を 1.5 mL チューブに入れ,12,000 rpm, 3 min 程度の遠心で集菌する。
  3. 上清の LB 培地 を除去する。
  4. これを繰り返し,4.5 mL の培養液から集菌する。3 回目はピペットで上清を完全に取り除く。
  5. Solution I を 200 µl 加え,ピペッティングで懸濁する。
  6. Solution II を 400 µl 加え,チューブを数回上下に反転させて混ぜる。
    • アルカリ溶液で細胞を溶解するステップ。ここで激しく混ぜると,ゲノム DNA が断片化してプラスミド溶液に混入するので,穏やかに混合すること。
    • 断片化していないゲノム DNA は,タンパク質と絡みついて次のステップで沈殿するため,プラスミド DNA と分離することができる。
  7. Solution III を 400 µl 加え,チューブを数回上下に反転させて混ぜる。白い沈殿が生じる。
  8. ~10,000g, 15 min, 4℃ で遠心。
  9. 上清 750 µl を新しいチューブに移し,等量のイソプロパノールを加える (イソプロ沈殿)。
  10. ~10,000g, 15 min, 4℃ で遠心。
  11. ピペットで上清を除き,1 mL の 70% エタノールを加える。
  12. ピペットで上清を除き,減圧下で 5 分間乾燥させる。
  13. 沈殿を 50 µl の滅菌水または TE buffer に溶解する。

この方法で得られたプラスミドには,RNA が混入している。したがって,通常は RNAse 処理を行い,フェノール/クロロホルム沈殿によって RNAse を除去する作業が続く。


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References

  1. 高知大学 生体機能物質工学実験 II マニュアルより. Link.
  2. Sigma Aldrich. じっけんレシピ. Pdf file.
  3. Green and Sambrook, 2012a. Molecular cloning: A laboratory manual, 4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.


  1. Chemical Book. Link: Last access 9/1/2017.
  2. Potassium lauryl sulfate. Link: Last access 9/1/2017.

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