コンピテントセルの作り方,保存方法

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7-15-2017 updated


  1. 概要: コンピテントセルとは
  2. プロトコール: Cocoa Biotech
  3. その他のプロトコール

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概要: コンピテントセルとは

プラスミドを細胞に導入することを形質転換 transformation といい,薬品で処理することによってプラスミドを取り込みやすくなった細胞をコンピテントセル competent cell という。


プロトコール: Cocoa Biotech

コンピテントセル作製のプロトコールはたくさんあるが,Cocoa Biotech の方法がシンプルで好きである。

  1. DH10, DH-5α などのコロニーをピックアップし,6mL の LB 培地 で 37°C で振盪しながら終夜培養する。
  2. この培養液を 300 mL の LB に加え,550 nm の吸光度が 0.45 - 0.55 になるまで培養する。約 2 時間。
  3. 50 mL チューブ中,2,500 rpm, 15 min 遠心する。以降の作業は全て氷冷下で行う。
  4. 上清を完全に除き,15 mL 氷冷 0.1 M MgCl2 に大腸菌を懸濁。
  5. 2,500 rpm, 15 min で遠心,上清を除き 20 mL 氷冷 0.1 M CaCl2 に懸濁。
  6. 氷上で 20 min 静置し,2,500 rpm, 10 min 遠心。
  7. 上清を完全に除き,6 mL の 0.1 M CaCl2/15% グリセロール に再懸濁。
  8. 100 µL ずつに分注し,-80°C で保存する。

注意事項など

0.1 M 塩化マグネシウムで大腸菌を懸濁するステップで,間違って 1 M のストック溶液を使ってしまったことがあったが問題なし。大腸菌は高塩濃度に強いのかもしれない。

保存は -80°C を書かれており,私もグリセロールストックの保存は -80°C だと思っていたが,グリセロールストックの作り方 のページにあるように,有名な実験書 Molecular Cloning (Amazon link) では,グリセロールストックは -20°C で保存できると書かれている。

ただし,コンピテントセルは普通のグリセロールストックとは違うので,温度が高いと徐々にコンピテンシーが失われていくということもあるのかもしれない。


その他のプロトコール

その他のプロトコールについては詳述せずに,特徴を表にまとめる。


リンク メモ
三重大学 塩化カルシウム法: CaCl2 のみを使っている。

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References

  1. Preparation of competent E. coli cells using calcium chroride. Cocoa Biotech. Link: Last access 7/15/2017.