1. 概要: SOD とは
2. Cu/Zn SOD
   • TG mice
   • KO mice
   • その他の生物
3. Mn SOD
   • KO mice
4. Extracellular SOD
5. SOD 活性の測定法

概要: SOD とは

スーパーオキシドジスムターゼ (SOD; superoxide dismutase; EC 1.15.1.1) は、活性酸素 であるスーパーオキシド O₂^- と水素イオン H⁺ から、酸素 と 過酸化水素 を生成する反応を触媒する酵素である。

スーパーオキシドは、キサンチンから尿酸を生成する反応、NADPH - チトクローム P450 還元酵素による酸素の 1 電子還元などによって生成する (6)。

2O₂^-+ 2 H⁺ → O₂ + H₂O₂

この反応は、1 種類の物質である O₂^- が反応して O₂ および H₂O₂ になる反応であり、不均化反応 dismutation の一種である。

SOD の活性中心には 2 価の金属 Cu, Fe, または Mn が含まれる。金属の種類と細胞内局在によって、SOD は一般に以下ように分類されている。

Cu/Zn SOD

Cu/Zn SOD は、活性中心に銅原子 Cu を含む SOD で、主に真核生物の細胞質に局在する。ミトコンドリア の intermembrane space にもあると書かれている (2)。Zn は構造の安定化に重要であると考えられている。

Cu/Zn SOD transgenic mice

• Human genome fragment containing the SOD1 gene Tg mice の Cu/Zn SOD 活性は 2 - 5 倍高く、MEF のパラコート耐性も高いが、寿命は野生型と同じである。
• Cu/Zn SOD & catalase, Cu/Zn SOD & Mn SOD double transgenicも、寿命は野生型と同じ (1,3)。

Cu/Zn SOD ノックアウトマウス

Cu/Zn SOD^-/- mice は以下のような表現型を示す。

• 酸化ストレスに弱く、寿命も野生型より 30% 短い (1)。
• DNA に蓄積する酸化ダメージは、野生型マウスの数倍高い (1)。
• 卵巣機能不全を示し不妊である (1)。
• 睾丸が小さくなり、細胞間に隙間が生じる。熱ストレス下で精原細胞の機能が阻害される (4)。
  • アポトーシスが増え、熱ストレス後の細胞の精原細胞の生存率が低下する。
  • これは ROS scavenger によってされる。熱ストレスで生じる活性酸素が増えていると思われる。

Cu/Zn SOD^+/- mice の寿命は野生型と同じで、酸化ストレス耐性に関する情報は 2009 年時点ではない (1)。

その他の生物

Drosophila

• ただし炭水化物量が多いときのみ。
• 餌のタンパク質/炭水化物比率の変化で寿命が変化する。タンパク質制限ではTORシグナルが低下。
• SOD1 の過剰発現は、寿命延長の十分条件ではない。
• タンパク質制限で寿命が延びたときにも、酸化ストレス耐性は上がらない。

Mn SOD

Mn SOD ノックアウトマウス

Mn SOD のホモノックアウトは、拡張性心筋症になり生後早期に死亡する (7)。脂肪肝、代謝性アシドーシス、神経変性の症状も示す。

SOD 活性を有する小分子の投与によって、これらの症状は部分的に回復するが、それでも生後 40 日程度で死亡する (7)。

> Mn SOD の conditional KO についてまとめた日本語総説 (7)。

• 肝臓特異的 KO では、肝機能障害や脂肪蓄積が認められない。Cu/Zn SOD による保障でもなく、過酸化脂質量も増えない。
• 心筋・骨格筋特異的 KO では、拡張型心筋症や運動能力の低下が認められ、生後 6 ヶ月までに脂肪。ミトコンドリア異常、呼吸鎖複合体 I, II, III, V サブユニット量減少など。これらの症状は EUK-8 などの投与でレスキューされる。
• 骨格筋特異的 KO は正常に発育。中心核 centralized nuclei が認められ、筋肉が再生していると考察された。自発行動量は変わらないが、骨格筋 ATP および強制走行力は低下。

SOD 活性の測定法

SOD の活性測定法は、原則的に以下の 2 ステップに分けられ、それぞれに複数の方法がある (6)。

1. O₂^- を発生させる段階
   • キサンチン - キサンチンオキシダーゼ反応
   • フラビンの光還元反応
   • Phenazine methosulfate (PMS) の NADH による還元反応を利用する
   • ピロガロールやヘマトキシリンの自動酸化を利用する方法
   
   
2. SOD による O₂^- の減少を測定する段階
   • 直接測定法 [電子スピン共鳴 (ESR)、ポーラログラフ法、化学発光法および UV 法など]
   • 間接測定法 (チトクローム c 法、NBT 法、亜硝酸法、ピロガロール自動酸化法など)

以下、段階 2 の間接測定法について解説する。

シトクロム c 法

SOD の存在を示すために最初に用いられた方法 (6)。O₂^- によってヘムタンパク質である シトクロム c の Fe³⁺ が Fe²⁺ に変化する。この変化を 550 nm の吸光度で測定する (6)。

NBT 法

O₂^- によって NBT (nitroblue tetrazolium) を還元し、生成したホルマザンを 560 nm で測定する (6)。反応の停止に CuCl₂ を用いることで、ホルマザンが 3 時間以上安定に保たれるため、検体が多いときの測定に適する。

シトクロム c 法に比べ特異性はやや劣るが、感度は高い (6)。

References

1. Trost et al. 2010a. The complete genome sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41 isolated from a 12-year-old girl with necrotizing lymphadenitis reveals insights into gene- regulatory networks contributing to virulence. BMC Genomics 11, 728.
2. Perez 2009a (Review) Biochem Biophys Acta 1790, 1005-1014.
3. Perez 2009b. Aging Cell 8, 73-75.
4. Ishii et al. 2005a. Accelerated impairment of spermatogenic cells in sod1-knockout mice under heat stress. Free Radic Res 39, 697-705.
5. Sun et al. 2012a. Nutrient-dependent requirement for SOD1 in lifespan extension by protein restriction in Drosophila melanogaster. Aging Cell 11, 783-793.
6. 佐野, 富田 1992a. 抗酸化酵素の測定. 化学と生物 30, 743-747.
7. 清水, 白澤 2009a. Mn SOD コンディショナルノックアウトマウスを用いた抗老化研究. 薬理学雑誌 130, 19-24.

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