NIH の遺伝子組換え実験ガイドラインについて

UBC/experiments/safety/recombinant_nih_guideline

このページの最終更新日: 2020/06/11

  1. タンパク質発現実験を行うのに必要な手続き
  2. どのような実験が exempt か

広告

タンパク質発現実験を行うのに必要な手続き

このページでは、大腸菌を使ったタンパク質発現 実験などを行う際に必要となる手続きについて、NIH のガイドラインをもとにまとめる。着目するのは「どのような実験ならば面倒な手続きが不要になるか」という点である。


アメリカでは、NIH の Biosafety and Recombinant DNA Policy に準拠するのが一般的である。このポリシーの中に NIH Guidelines for Research Involving Recombinant or Synthetic Nucleic Acid Molecules という項目があり、単に NIH Guidelines といった場合にはこれを意味することが多い。

NIH Guidelines (April 2019) によると、遺伝子組み換え実験は、以下の 6 つのカテゴリーに分類される。

  1. those that require NIH Director approval and Institutional Biosafety Committee (IBC) approval before initiation (see Section III-A)
  2. those that require NIH OSP and Institutional Biosafety Committee approval before initiation (see Section III-B)
  3. those that require Institutional Biosafety Committee approval before initiation of human gene transfer (see Section III-C)
  4. those that require Institutional Biosafety Committee approval before initiation (see Section III-D)
  5. those that require Institutional Biosafety Committee notification simultaneous with initiation (see Section III-E)
  6. those that are exempt from the NIH Guidelines (see Section III-F).

1 が最も厳しい基準であり、NIH ディレクターおよび各機関に設置された IBC の承認が必要となる。順に基準が甘くなり、5 では承認不要・IBC に「知らせる」だけで良い。6 は完全に exempt である。


どのような実験が exempt か

大腸菌を使ったタンパク質発現実験は、よほど毒性の高いものを発現させたりしていない限り exempt であり、承認は不要である。その根拠をみていこう。

まず、上記の 6 を根拠に Section III-F へ。以下のような文章があり、8 項目が exempt として挙げられている。CDC など他の基準が適用される場合があるとの但し書きがある。

The following recombinant or synthetic nucleic acid molecules are exempt from the NIH Guidelines and registration with the Institutional Biosafety Committee is not required; however, other federal and state standards of biosafety may still apply to such research (for example, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)/NIH publication Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories).


まず、第 1 項目は以下の通り。原文は NIH Guidelines (April 2019) を参照のこと。

1. Those synthetic nucleic acids that: (1) can neither replicate nor generate nucleic acids that can replicate in any living cell (e.g., oligonucleotides or other synthetic nucleic acids that do not contain an origin of replication or contain elements known to interact with either DNA or RNA polymerase), and (2) are not designed to integrate into DNA, and (3) do not produce a toxin that is lethal for vertebrates at an LD50 of less than 100 nanograms per kilogram body weight. If a synthetic nucleic acid is deliberately transferred into one or more human research participants and meets the criteria of Section III-C, it is not exempt under this Section.


いきなり長い項目。意訳してみよう。

  1. あらゆる生細胞の中で複製しない合成核酸、または複製しうる核酸を作り出さない合成核酸。
    • これはつまり、複製起点をもたない核酸および DNA polymerase や RNA polymerase と結合することが知られている配列をもたない核酸、ということ。
    • つまりプラスミドは該当しないが、ほとんどのプライマーや、それを使って得られる PCR product などは該当する。
    • したがって、たとえば リアルタイム PCR は原則として exempt になる。
  2. are not designed to integrate into DNA. プラスミドが該当しなさそうなことは分かるが、これはちょっと実例が思いつかない。
  3. 脊椎動物への毒性が低い (LD50 が 100 ng/kg 以下) のものを合成する核酸。ただし、ヒトに摂取させる場合はこの限りではない。

よくわからなかったので NIH に問い合わせたところ、これは 合成核酸に限定した記述 であり、exempt になるのは、1 から 3 のすべてに該当した場合であるとのことであった。英文法的にも A and B and C という構造になっている。


広告

Plasmid はどうか?

では次に plasmid について考えてみる。項目 2 を見てみよう。

2. Those that are not in organisms, cells, or viruses and that have not been modified or manipulated (e.g., encapsulated into synthetic or natural vehicles) to render them capable of penetrating cellular membranes.


「生物やウイルスの中には存在せず、かつ細胞膜を通り抜けるように modify されていないもの」である。単純なプラスミド溶液や PCR 産物は、これに該当すると思われる。

ただし、大腸菌をトランスフォームした状態では plasmid は organism の中にあり、発現実験では transformation を避けて通ることはできないので、この項目だけでは exempt とは言えないだろう。


3. Those that consist solely of the exact recombinant or synthetic nucleic acid sequence from a single source that exists contemporaneously in nature.


他の項目を解説しようと思ったが、長くなる上にわかりにくいので、一気に結論まで行くことにする。下記の項目 8 から、さらに別のセクションに飛ばされる。Appendix C である。

8. Those that do not present a significant risk to health or the environment (see Section IV-C-1-b-(1)-(c), Major Actions), as determined by the NIH Director following appropriate notice and opportunity for public comment. See Appendix C, Exemptions under Section III-F-8 for other classes of experiments which are exempt from the NIH Guidelines.


Appendex C を見てみると、次のような記述がある。

Appendix C-II. Escherichia coli K-12 Host-Vector Systems.

Experiments which use Escherichia coli K-12 host-vector systems, with the exception of those experiments listed in Appendix C-II-A, are exempt from the NIH Guidelines provided that: (i) the Escherichia coli host does not contain conjugation proficient plasmids or generalized transducing phages; or (ii) lambda or lambdoid or Ff bacteriophages or non-conjugative plasmids (see Appendix C-IX-B, Footnotes and References of Appendix C) shall be used as vectors. However, experiments involving the insertion into Escherichia coli K-12 of DNA from prokaryotes that exchange genetic information (see Appendix C-IX-C, Footnotes and References of Appendix C) with Escherichia coli may be performed with any Escherichia coli K-12 vector (e.g., conjugative plasmid). When a non-conjugative vector is used, the Escherichia coli K-12 host may contain conjugation-proficient plasmids either autonomous or integrated, or generalized transducing phages. For these exempt laboratory experiments, Biosafety Level (BL) 1 physical containment conditions are recommended. For large-scale fermentation experiments, the appropriate physical containment conditions need be no greater than those for the host organism unmodified by recombinant or synthetic nucleic acid molecule techniques; the Institutional Biosafety Committee can specify higher containment if deemed necessary.


ケンタッキー大学の資料 も参考に読み解いてみる。大腸菌実験に絞って記載する。

  • E. coli K-12 host-vector systems を使った実験は exempt である。
  • 培養が 10 L 以上になる場合は exempt ではない。

さらに、K-12 host-vector system には additional requirement がある。

  1. E. coli host が conjugation proficient plasmids および generalized transducing phages を含まないこと。
  2. ベクターとして Lambda or lambdoid or Ff bacteriophages or non-conjugative plasmids が使われていないこと。

K-12 については 大腸菌株のページ に記載した。なお、真核生物細胞を使った発現系は IBC の承認が必要な模様。


広告

References


コメント欄

各ページのコメント欄を復活させました。スパム対策のため、以下の禁止ワードが含まれるコメントは表示されないように設定しています。レイアウトなどは引き続き改善していきます。「管理人への質問」「フォーラム」へのバナーも引き続きご利用下さい。

禁止ワード: http, the, м (ロシア語のフォントです)


このページにコメント

Name:


Comment:



これまでに投稿されたコメント

Date Name Comment