1. 概要: タンパク質発現系とは
2. 大腸菌発現系のトラブルシューティング
   • 誘導前に異種タンパク質が発現してしまう

関連ページ

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• この実験を行うのに必要な手続き
• Plasmid のページに、ベクターの一覧あり。

概要: タンパク質発現系とは

まずは、発現系を選択する必要がある。

大腸菌発現系のトラブルシューティング

大腸菌発現系でよく用いられる pET システムの文献 (1) より。pET システムの詳細は IPTG による発現誘導 のページにまとめた。

誘導前に異種タンパク質が発現してしまう

一般に、異種タンパク質を発現することは大腸菌によってストレスである。異種タンパク質自体が毒性をもっていることもあり、発現誘導前の異種タンパク質発現は、極力低く抑えるべきである。

これには、以下のような方法がある (1)。

1. 図 (Public domain) のように、pET プラスミドにも lacI 遺伝子と lac operator を追加する。多くの pET ベクターはこの構造になっている。
2. pET プラスミドと和合性がある (大腸菌内で共存できる) pLysS または pLysE というプラスミドに、T7 RNA ポリメラーゼを阻害するリゾリームの遺伝子を入れ、これで大腸菌を形質転換する。おそらく、IPTG 誘導がかかったときの T7 RNA ポリメラーゼの発現は大量なので、タンパク質収量にはあまり影響せず、誘導前に少量転写されてしまう T7 RNA ポリメラーゼを阻害することのメリットが大きいと考えられる。
3. lac プロモーターは、培地中の グルコース 不足で活性化する。これを防ぐために L8-UV5 という変異の入った lac プロモーターが使われているが、培地に終濃度 0.5 - 1% のグルコースを添加することで、さらにプロモーター活性を下げることができる。

References

1. 東端 2013a (Review). 大腸菌を宿主とした異種タンパク質高発現のイロハ. 生物工学 91, 96-100.

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