1. DNA 検出試薬と検出可能な DNA 量
2. プロトコール
   • アガロースゲル
   • ポリアクリルアミドゲル

DNA 検出試薬と検出可能な DNA 量

アガロースゲル電気泳動で検出できるで DNA 量は、染色試薬の種類による。もっとも有名なエチジウムブロマイド ethidium bromide で安定的に検出される DNA 量は 約 10 ng である (1, 参考: DNA に関係した数字の一覧)。鮮明なバンドとして検出したい場合は約 100 ng が必要。その他については、以下の表を参照のこと。

ただし、これらは 見たいバンドの DNA 量であることに注意が必要。たとえば 制限酵素によるベクター構築後に、制限酵素 で切り出してインサートの有無を確認したい場合、vector 3 kb、insert 1 kb だとすれば、総量の 1/4 が 10 ng を超えていないといけない。インサートが短い場合は、さらに量が必要になる。

プロトコール

アガロースゲル電気泳動

1. 1 - 2% 程度 (w/v) のアガロースを TAE または TBE buffer に加える。
2. 電子レンジで溶かす。突沸しないように、ときどき電子レンジを止めてかき混ぜる。
3. 適切な温度まで冷やす。
4. エチジウムブロマイド ethidium bromide などの DNA 検出試薬を加え、型に流し込む。

なぜ緩衝液を使うのか？

DNA そのリン酸基で負に荷電しており、これが正電極に引きつけられるのが電気泳動の原理である。溶液が酸性に傾くということは、溶液中に H⁺ が大量に存在するということであり、H⁺ によってリン酸基の負電荷が中和されるということ。したがって、DNA 電気泳動の溶液はアルカリ性に偏っている必要があり、さらに pH が変わりにくいように緩衝能をもつ必要がある。これが TAE, TBE などの緩衝液を使う理由である。

参考になるページ: 核酸、酸と塩基の定義、緩衝液

TAE と TBE はどう違う？

TAE は Tris-acetate EDTA, TBE は Tris-borate EDTA である。一般にアガロースゲル電気泳動では 1 x TAE または 0.5 x TAE が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動では 1 x TBE が使われる (3)。

かつては TAE の方がゲルからの DNA 回収効率が高かったため、アガロースゲル電気泳動では主に TAE が使われてきた (1)。最近のキットは TBE からの回収率が上がっているようなので、基本はどちらでも良いと思われる。

TAE の方がわずかに実際的なメリットがある。すなわち TBE よりも安く、ストック溶液を高濃度 (50x) で保存できる。TBE のストック溶液は 10x である。

なぜ EDTA を入れるのか？

EDTA は Mg²⁺ のキレート剤である。Mg²⁺ は DNAse を活性化するので、DNA の分解を防ぐために EDTA を入れる。

エチジウムブロマイドの安全性

DNA の電気泳動では、DNA を染色するためゲルにエチジウムブロマイドを加える。泳動後のゲルをエチブロを含むバッファーに浸したり (後染め)、SYBRSafe などの「安全」な試薬を使うこともある。

一般にエチブロは「危険」な試薬として扱われているが、実のところその毒性は通常の実験試薬と同程度である (6)。

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References

1. Lonza 技術情報 電気泳動・分析. Pdf file.
2. じっけんプロトコール, Sigma. Pdf file.
3. TAEバッファーとTBEバッファーの比較. BioWiki. Link.
4. Green and Sambrook, 2012a. Molecular cloning: A laboratory manual, 4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

5. TAEバッファーとTBEバッファーの比較. Link: Last access 9/1/2017.
6. The Myth of Ethidium Bromide. Link: Last access 11/06/2017.