1. プライマー設計で重要なパラメーターと基本ルール
   • 長さ
   • GC 含量
   • TM 値
   • 二次構造
   • 特異性
2. プライマー設計用のウェブサイト
   • Primer-BLAST
   • Primer3
   • IDT Oligo Analyzer
3. ロング PCR 用のプライマー
4. 縮重プライマー
5. 汎用プライマーの配列

別ページ

• 制限酵素サイト付きプライマーの設計

プライマー設計で重要なパラメーターと基本ルール

プライマー設計では、多くのパラメーターが「あちらを立てればこちらは立たず」という状況にある。したがって「常にベストなプライマー配列」というものは存在せず、PCR の目的に応じて最適なプライマーを設計する必要がある。考慮すべきポイントの概要は以下の通り。

このページでは、長さ、GC 含量などの項目についてまず一般的な内容を述べ、次に リアルタイム PCR、ロング PCR などのアプリケーションについての情報がある場合には、それらを追記するという形をとる。

長さ

18 - 30 塩基程度。長いプライマーは特異性が上がるが、アニーリング効率が下がるので収量は低下する (1)。

GC 含量

• 40-60% にする (1)。
• G および C が連続して存在しないようにする (1)。

Tm 値

• 55-65°C にする (1)。

二次構造

プライマーが二次構造を作らないような配列にする (1)。

特異性

プライマー配列を BLAST したときに、forward と reverse が同じ遺伝子に top hit するか？ 塩基同一率と e-value は？

プライマー設計用のウェブサイト

様々なウェブサイトがあるが、管理人が現在使っているのは Primer-BLAST で設計し、その配列を IDT Oligo Analyzer でさらに検証するという方法である。ただしこれはリアルタイム PCR プライマーの設計時で、普通の PCR プライマーのときは IDT Oligo Analyzer によるチェックは省くことが多い。

Crafting qPCR Primers: NCBI Primer BLAST for Beginners という論文 の流れに極めて近い。

Primer-BLAST

2024 年上半期、Google Scholar で 2270 件の論文がヒットし、下記の Primer3 よりも使われている様子。BLAST と組み合わさっているので、生物種を指定すると、他のテンプレートから増えてしまう可能性のあるペアには Products on potentially unintended templatesという警告が出る。

Primer3

かなり昔からあるソフトだが、Google Scholar で Primer3 + qPCR で検索したところ、2024 年上半期に出版されたものだけでも 1650 件の論文がヒットした。まだ十分に使われているようだ。

Google 検索の結果で目立つのは Primer3 だが、Primer3plus の方がいろいろと便利。プライマーをピックアップした後、Primer 3 Manager を使って BLAST したりすることができる。

IDT Oligo Analyzer

IDT が提供するウェブページ。IDT のアカウントが必要。

使用方法は以下の通り。

1. プライマー配列をボックスに入力し、各種パラメーターを設定する。
2. Oligo conc は通常 0.25 µM 程度。デフォルトでこの値に設定されている。
3. Mg²⁺ 濃度は、一般に 1 - 4 mM、dNTP 濃度は一般に 0.2 mM each。

ヘアピン構造の予測では、Gibbs の自由エネルギー変化などの熱力学的パラメーターまでちゃんと出てくる。

ΔG の単位は kcal/mol など。ヘアピン構造を取る際の自由エネルギー変化。この値がマイナスであれば、ヘアピン構造の方がエネルギー状態が低いということで、この反応が自発的に起こる。つまり、放っておくとプライマーがどんどんヘアピン構造に変化していくということ。

上の例の場合、自由エネルギー変化は正であるので、この反応は自発的には起こらない。ただし、自由エネルギー変化の値が小さいということは、その構造変化が起こりやすいということでもある。

PCR の場合、ヘアピン形成の際の自由エネルギー変化だけではなく、プライマーとテンプレートが二本鎖を形成する際の自由エネルギー変化も重要な因子である。両者を混同しないように注意すること。

プライマーダイマーの予測は、homo(self)-dimer と hetero-dimer に分かれている。もちろん、hetero-dimer 形成を予測したい場合は、もう一つのプライマーの配列を入れる必要がある。この場合も、自由エネルギー変化 ΔG が計算される。

DNA は基本的に二本鎖になっていた方が安定なので、この場合、ΔG は基本的に負になる。負の絶対値が大きいほど、プライマーダイマーが形成されやすくなる。どの程度なら OK かというのは場合によるが、一般的な指標としては、ΔG は 常に -9.0 kcal/mole 以上 というのが一つの目安のようだ。

Crafting qPCR Primers: NCBI Primer BLAST for Beginners に、ヘアピンとΔGに関する言及がある。

• Ensure that the melting temperature of the hairpin structures is lower than the annealing temperature of the PCR reaction (50°C).
• Make sure the ΔG of the homodimers are greater than -9 kcal/mole (so, less negative values or positive values).

その他ソフト

Beacon Designer というのもあって、これは有料。ただしフリートライアルも可能。

PrimerExpress は旧 ABI の時代からあったソフト。これも有料。

ロング PCR 用のプライマー

• 長いプライマーを使う。文献 2 では 26 塩基。
• Tm 値を高めにする。文献 2 では 68°C。

プライマー配列がユニークであること、標的配列中に SNP がないこと。これらは普通の PCR プライマーでも重要であるが、より難しいロング PCR ではクリティカルである。

縮重プライマー

多くの生物でゲノム配列が手に入る現在、縮重プライマーに対する需要は激減している。CODEHOP や HYDEN のように有名だった縮重プライマー設計ツールも閉鎖しているという状態だ。

DECIPHER の primer 設計は、複数の配列から target 配列を特異的に増幅するプライマーを設計するためのもので、縮重プライマーとは別のものだった。2019 年 2 月 11 日に修正。

縮重塩基の一文字表記

ThermoFisher のプライマー注文画面から見ることができる、塩基の IUPAC code をまとめておく。通常の A, T, C, G, U の他の塩基である。

汎用プライマーの配列

汎用プライマーの配列は、文献によって多少配列が異なる場合が多い。出典とともに示しておく。

配列は Eurofins, Addgene などから。

References

1. Roche オンラインマニュアル. プライマー設計とテンプレートの調製. Pdf file.
2. 国立遺伝学研究所 細道一善. 疾患関連遺伝子の long-range PCR Nextera 解析. Pdf file.

アップデート前、このページには以下のようなコメントを頂いていました。ありがとうございました。これはおそらく、プライマーが長いと Tm 値も上がるため、同じ温度でのアニーリング効率が低下するということだと思います。

Tm 値にはいくつか計算方法がありますが、たとえば このページ に例が載っています。基本的には、プライマーが長いほど、また GC 含量が高いほど Tm も高くなります。

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