脳抽出物の定量 H-NMR

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6-13-2017 updated

  1. 概要
  2. 1H-NMR spectrum
  3. 抽出方法
  4. 内部標準
  5. トラブルシューティング
    • ダブルピーク、pH の影響

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概要

このページでは、脳に含まれる代謝産物を 1H-NMR または 1H magnetic resonance spectroscopy (MRS) で定量する方法について解説する。

定量 1H-NMR のページ にもあるように、1H-NMR を用いた代謝産物の定量は、以下のような利点と欠点をもっている (2)。

利点

  • 1H は、最も NMR 感受性の高い原子核である。これは、gyromagnetic ratio においても、natural abundance (99.9% 以上) においても言えることである。
  • ほとんどの代謝産物は H を含んでいる。

欠点

  • 水 water の巨大なピークが現れてしまうため、water suppression が必要となる。
  • 同様に、脂質 lipid やタンパク質 protein などのピークと代謝産物のピークが重なることが多い。これは、ケミカルシフト の範囲が約 5 ppm と狭いためでもある。
  • 以上のことと関係して、的確なシム shim による磁場の均一性が非常に重要である。

このように多くの難点をもちながらも、1H NMR では ヒト、齧歯類の脳で 15 から 20 個の代謝産物を同時に、さらに in vivo MRS では非侵襲的に定量することが可能 であり、脳の働きを理解するために有効なツールと言える。


1H-NMR spectrum

以下は、典型的なラット rat 脳の 1H-NMR spectrum である。ケミカルシフト値は、total creatine の値を 3.03 ppm として補正してある。


ラット脳抽出物のH-NMR


内部標準

NAA, クレアチンおよび 水 が in vivo MRS の内部標準として提唱されている (2)。ただし、NAA の濃度は病気で低下するし、また水の量は voxel に CSF が含まれると大きく変わるので注意が必要である。

31P NMR では、total phosphate pool が一定であるとして標準化する方法もある (2)。


トラブルシューティング

ダブルピーク、pH の影響

ピークが割れる現象 (ダブルピーク) の原因は、大体の場合 shim が不十分なためであるが、緩衝液が古かったりして pH が合っていない場合にも見られることがある。経験上、両性イオンであるグルタミン酸 や GABA のピークが割れやすい傾向にあるように思う。

赤が pH 調整前、青が pH 調整後。周波数の微調整はしていないが、2.3 ppm 付近のグルタミン酸の 3 つのピークが割れているほか、パターンの違いが顕著である。

Effect of pH on Glu peaks

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References

  1. Govindaraju et al. 2000a.Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites. NMR Biomed 13, 129-153.
  2. de Graaf 2007a. In viso NMR Spectroscopy.

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