HPLC: プロトコールを中心に

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このページの最終更新日: 2024/02/14

  1. 溶媒の準備
  2. HPLC のパージ
  3. サンプルの準備
    • 必要なサンプル量
    • サンプルの filtration
  4. Tips
    • 系を安定させることが重要: UV ランプ、流速など

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溶媒の準備

溶媒は HPLC グレードのものを使用する。


水を使う場合

HPLC グレードの有機溶媒を使う場合は、脱気にのみ注意すれば良い。まずは、緩衝液など水系の溶媒を使う場合の注意点をまとめる。

水道水は論外 (3)。UV 殺菌、活性炭、0.22 µm フィルターで処理した超純水でも、多少の不純物が存在するというデータが示されている (3)。イオン交換カートリッジに通すだけだと、かなりの不純物が存在する。プレクリーン ORG という水中の不純物を除去するプレカラムの使用が推奨されている (3)。

> フィルターは 0.22 µm でなく 0.45 µm で十分 なようである。

  • この Shodex のページ では、溶離液と試料はゴミや不溶性物質を取り除くため 0.45 µm のメンブランフィルタで濾過してくださいと書かれている。
  • GE Healthcare の HPLC mobile phase filtration のカタログでも、0.45 µm のフィルターが載っている。

HPLC のパージ

HPLC を扱う上でまず注意しなければならないのは、カラムに空気を入れないこと である。まず、HPLC の模式図 (1) を使い、パージの方法を述べる。

HPLC の基本的なシステム構成は以下のようになっており、パージ purge とは流路から空気を除き、送液を安定化する作業のことである。


  • 移動相とそれを流すポンプ
  • サンプルインジェクター (オートサンプラー)
  • カラム、カラムオーブン
  • 検出器
  • フラクションコレクター


パージの手順はもちろん使用する機器によって異なるので、詳細はマニュアルを参照のこと。ただし、私の経験ではほとんどの HPLC が同じようなシステムを採用しているので、理解を助けるために、私が使っているシステムを参考にまとめる。

ポンプに空気が混入すると、圧力が安定しなくなる。たとえば solvent が枯れてしまうと、図の赤および青のラインに空気が混入する可能性がある。

普通の HPLC システムでは、ポンプよりも下流、サンプルインジェクターおよびカラムよりも上流に purge valve がある。


これを開けると、溶媒はサンプルインジェクターの方へ流れず、直接廃液の方へ流れるようになる。カラムに空気を入れたり、余計な圧力をかけたりしないために、purge の際には常に purge valve を開けておく必要がある。

サンプルの準備

必要なサンプル量

必要なサンプル量は、もちろん目的や検出方法に依存する。ここでは一般論を示す。UV-Vis は一般に ng 単位の試料の検出が可能である (5)。

  • たとえば、10 µM DNA 溶液を 10 µL インジェクションすると、きれいなピークが見える。

サンプルの filtration

サンプルも、溶媒と同様に 0.45 µm フィルターに通す必要がある。

目で見て沈澱が見られるようなサンプルは論外 (6)。一般に、汚いサンプルを流すとカラムの寿命を縮める。目に見えないレベルの沈殿物も、カラムのとくにエンドフィッティングの部分に詰まって圧力上昇の原因になる。

サンプルのインジェクション

新しい機械では、サンプル注入もオートサンプラーで自動で行われることが多いだろう。かつては、写真 (Public domain) のようにシリンジでインジェクションしていた。

HPLC の tips

系を安定させることが重要

検出を吸光度でしている場合、系を安定させることが重要である。具体的には、UV ランプは測定の 30 分ほど前にはつけておくこと、流速をいちいち変えないことなど。

多くの要因が吸光度に影響してしまうという挙げよう。下の図は、無事にサンプルを検出した後に、ポンプを一度ストップし、再度 ON にするというのを 2 回繰り返した結果である。

縦軸が吸光度。シアンの吸光度はおかしなことになっているので、紫のラインをみてほしい。ポンプをいじっただけで、吸光度が大きくジャンプしており、安定化するまでに数分を要していることがわかるだろう。


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References

  1. By GYassineMrabetTalk✉This vector image was created with Inkscape. - Own work, CC BY 3.0, Link
  2. HPLCの上手な使い方. Ⅱ章－２ HPLCで使用される溶媒. Link: Last access 2019/06/20.
  3. HPLCの上手な使い方. Ⅱ章－３ 水中の不純物について. Link: Last access 2019/06/20.
  4. カラム取扱上の一般的注意事項. Shodex. Link: Last access 2019/06/26.
  5. HPLCの基礎 (4) 各種検出器の特徴 Jasco. Link: Last access 2019/08/05.
  6. ガードカラムの必要性とは・・・・ Link: Last access 2021/04/18.

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