HPLC の原理と概要: 順相、逆相、サイズ排除など
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このページの最終更新日: 2024/02/14- 概要: HPLC とは
- 逆相 HPLC
- 粒子径
- カラムの内径
- 移動相
- 順相 HPLC
- サイズ排除 HPLC
その他 HPLC 関係
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概要: HPLC とは
HPLC は high-pressure liquid chromatography の略で、高圧で行う液体クロマトグラフィーのことである。低圧での実験に比べカラムの担体の粒子が細かく、高密度に充填されている。そのため、実用的な流速を得るために高い圧力を必要とする (1)。
このページは、
HPLC の実際の取り扱いについては、HPLC: プロトコールを中心に のページが詳しい。
HPLC は、図 (7) のような一連の装置を使って行われる。主な構成要素は以下の通りである。
- 移動相とそれを流すポンプ
- サンプルインジェクター (オートサンプラー)
- カラム、カラムオーブン
- 検出器
- フラクションコレクター
![](../../images/wiki_ccby/HPLC.png)
HPLC の条件を決定する際に検討できる項目は、主に以下のようなものである (2)。
- カラム: ブランド、修飾基、サイズ (長さと内径)、粒子径
- 移動相: 移動相の種類 (有機溶媒か緩衝液か)、pH
- 試料: 注入量、試料溶媒
HPLC には以下のようなモードがある。基本的にはカラムと移動相によってモードが決定される。
- 分配モード、分配クロマトグラフィー
- 逆相モード
- 順相モード
- サイズ排除モード
- イオン交換モード
- イオン排除モード
逆相モード (逆相 HPLC) が最も使われている。
逆相 HPLC
極性の高い・低いは相対的な指標であるが、移動相の極性 > 固定相の極性となる場合に逆相系、そうでない場合を順相系という。ODS カラムとメタノールという組み合わせを覚えておけば、混乱することはないだろう。
逆相系の HPLC では、カラム内に疎水性の官能基が並んでいる。
よく使われる逆相カラムの一つに
ODS カラムは炭化水素鎖が長く、サンプルとの相互作用が強いカラムである (2)。溶出にかかる時間が長すぎる場合は、C8、C4、C3 などのカラムが使われる。
粒子径
一般に、カラムの粒子径は理論段数 theoretical plate と反比例する。理論段数はカラムの性能に関わる指標の一つで、数値が大きいほどピークがシャープになり、「良いカラム」であると判断される (ref 4, 計算式もリンク先にあります)。
一方、粒子径が小さいとカラムの圧力は高くなる。
カラムの内径
カラムの内径が細いと、
ただし、カラムの内径が細いほど、試料のバンド幅は広くなる (6)。試料溶媒を移動相と同じ、または移動相よりも極性を高くすることによって、試料溶媒の影響を抑えることができる。
一般的な内径は 5 mm 前後。分取した試料の使い道によって、数十 mm までスケールアップすることが可能である。内径が細いものが分析用、太いものが分取用。
移動相
一般に、逆相 HPLC の移動相には有機溶媒系と水系の混合溶液が用いられる (2)。
- 試料の疎水性部が反発を受けて、カラムのオクタデシル基と強く密着するようになる (2)。
- すなわち、系全体の疎水性部の表面積を小さくする方向に働く。
- その結果、試料の保持時間は長くなる。
アセトニトリル |
カラム圧や UV 吸収が低い (2)。最も汎用的で便利な有機溶媒と言える。 |
メタノール |
アセトニトリルよりもカラム圧が上がり、かつ UV を吸収してしまうが安価 (2)。 |
テトラヒドロフラン |
溶出力は大きいが、PEEK 樹脂を膨潤させる。試料が溶出しないときや、分離パターンを変えたいときに用いる。 (2)。 |
イソプロパノール |
溶出力は大きいが、カラム圧が高い (2)。試料が溶出しないときや、分離パターンを変えたいときに用いる。 |
移動相の pH が変わると、溶質の構造が変わって溶出時間も変化する。溶質が電離する -OH 基を含む場合などには特に影響が大きい。そのため、移動相には緩衝液を加え、pH を一定に保つのが一般的である。
順相 HPLC
順相 HPLC では、C18 基をつけないシリカゲルそのものなどが充填剤として使われる (5)。原理はシリカを使った TLC と同じで、シリカとサンプルが電気的に相互作用する。
逆相では、アセトニトリル、メタノールなど極性の高い溶媒を使うが、順相ではヘキサンなど極性の低い溶媒を使う。
サイズ排除 HPLC
とりあえずは ゲル濾過クロマトグラフィー を参照のこと。
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References
- Amazon link: ストライヤー生化学
: 使っているのは英語の 6 版ですが、日本語の 7 版を紹介しています。参考書のページ にレビューがあります。
- 一般財団法人化学物質評価研究機構 クロマト技術部. これでレベルアップ 逆相 HPLC におけるメソッド開発に役立つノウハウとトラブルシューティングの解説. Web (pdf).
- 逆相カラムの上手な使い方. Link: Last access 2018/05/05.
- 理論段数とは? 島津 HP. Link: Last access 2018/05/05.
- 第3部:逆相・順相、HILIC、イオン交換等のカラム. Link: Last access 2018/05/05.
- カラム内径の特徴と選択. Link: Last access 2018/05/08.
- By GYassineMrabetTalk✉This vector image was created with Inkscape. - Own work, CC BY 3.0, Link
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