In situ ハイブリダイゼーション: 原理、方法など

experiments/tissue_staining/in_situ
2018/03/15 更新


  1. 概要: in situ hybridization 法とは
  2. プローブの選択: DNA or RNA?
  3. 検出方法
    • 蛍光検出
    • 化学検出
  4. トラブルシューティング

広告

概要: In situ hybridization 法とは

In situ hybridization とは、標識した DNA または RNA のプローブを組織上で標的遺伝子の mRNA とハイブリダイゼーションさせることで、標的遺伝子の分布を調べる実験である。下の図 (1) のような染色像が得られる。組織全体がピンクに染まっているのは HE 染色、白い矢印で示された紺色の部分が in situ ハイブリダイゼーションのシグナルである。


Wei et al., 2011

Figure 2. Regionalized expression patterns of Nkx2-5, Nkx2-6, Isl1, Gata3, Foxg1 and Sox2 in the 3rd pharyngeal pouch at E10.5 (30–33 somites). Parasagittal sections (10–14 mm) of embryos that were hybridized to the indicated probes are shown. Anterior is up and dorsal is left. Arrowheads indicate the 3rd pharyngeal pouch. All of the genes are expressed in the ventral 3rd pouch except for Sox2 (F). Scale bar represents 100 mm. doi:10.1371/journal.pone.0026795.g002


プローブの選択: DNA or RNA?

ノーザンブロット Northern blot など、他のハイブリダイゼーションを基本原理とする実験でも同じであるが、プローブに求められる条件は 特異性と検出感度が高い ことである。

原則として、検出感度が高い → プローブと標的 mRNA の結合力が強い → 特異性も低くなりがちであることから、この条件に合うプローブを開発する努力が続けられてきた。長く使われてきた DNA および RNA プローブに加え、最近では LNA, PNA というプローブが使われている。


プローブ メリット デメリット
DNA
  • 合成が RNA プローブより簡単
  • 分解しにくい
  • アンチセンスを使ったネガティブコントロールを作れない
RNA
  • RNA-RNA hybrid は、DNA-RNA hybrid よりも Tm が高く安定。つまりハイブリ温度を上げることができる。
  • アンチセンス RNA でネガティブコントロールを作れる
  • DNA に比べて分解しやすい
LNA
PNA

検出方法

広告

コメント欄

コメントをどうぞ! (500 字まで)


フォーラムを作ったので、各ページにあるコメント欄のうち、コメントがついていないものは順次消していきます。今後はフォーラムをご利用下さい。管理人に直接質問したい場合は、下のバナーからブログへ移動してコメントをお願いします。


References

  1. Wei et al. 2011a. A focused in situ hybridization screen identifies candidate transcriptional regulators of thymic epithelial cell development and function. PLoS ONE 6, e26795.

Wei et al. (2011a) is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Also see 学術雑誌の著作権に対する姿勢.