HPLC: 原理、概要、プロトコール

experiments/chromatography/hplc
2018/05/09 更新

  1. 概要: HPLC とは
  2. 逆相 HPLC
    • 粒子径
    • カラムの内径
    • 移動相
  3. 順相 HPLC

広告

概要: HPLC とは

HPLC は high-pressure liquid chromatography の略で、高圧で行う液体クロマトグラフィーのことである。低圧での実験に比べカラムの担体の粒子が細かく、高密度に充填されている。そのため、実用的な流速を得るために高い圧力を必要とする (1)。

このページは、HPLC の原理および HPLC を実際に使う上で重要な点 を中心にまとめている。移動相、固定相、線速度など、クロマトグラフィー全般に当てはまる知識については、クロマトグラフィーの概要 のページを参照のこと。

HPLC は、図 (7) のような一連の装置を使って行われる。主な構成要素は以下の通りである。

  • 移動相とそれを流すポンプ
  • サンプルインジェクター (オートサンプラー)
  • カラム、カラムオーブン
  • 検出器
  • フラクションコレクター



HPLC の条件を決定する際に検討できる項目は、主に以下のようなものである (2)。

  • カラム: ブランド、修飾基、サイズ (長さと内径)、粒子径
  • 移動相: 移動相の種類 (有機溶媒か緩衝液か)、pH
  • 試料: 注入量、試料溶媒

HPLC には以下のようなモードがある。基本的にはカラムと移動相によってモードが決定される。

  1. 分配モード、分配クロマトグラフィー
    • 逆相モード
    • 順相モード

  2. サイズ排除モード
  3. イオン交換モード
  4. イオン排除モード

逆相モード (逆相 HPLC) が最も使われている。



逆相 HPLC

極性の高い・低いは相対的な指標であるが、移動相の極性 > 固定相の極性となる場合に逆相系、そうでない場合を順相系という。ODS カラムとメタノールという組み合わせを覚えておけば、混乱することはないだろう。

逆相系の HPLC では、カラム内に疎水性の官能基が並んでいる。

よく使われる逆相カラムの一つに ODS カラム がある。ODS は octadecyl silica であり、18 個の炭化水素基 -CH2 が並んでいる (末端は -CH3)。

ODS カラムは炭化水素鎖が長く、サンプルとの相互作用が強いカラムである (2)。溶出にかかる時間が長すぎる場合は、C8、C4、C3 などのカラムが使われる。


粒子径

一般に、カラムの粒子径は理論段数 theoretical plate と反比例する。理論段数はカラムの性能に関わる指標の一つで、数値が大きいほどピークがシャープになり、「良いカラム」であると判断される (ref 4, 計算式もリンク先にあります)。

一方、粒子径が小さいとカラムの圧力は高くなる。


カラムの内径

カラムの内径が細いと、移動相の溶媒を節約できる というメリットがある (6)。移動相の線速度が等しければ、内径を変えても保持時間や分離度は変わらない。

ただし、カラムの内径が細いほど、試料のバンド幅は広くなる (6)。試料溶媒を移動相と同じ、または移動相よりも極性を高くすることによって、試料溶媒の影響を抑えることができる。

一般的な内径は 5 mm 前後。分取した試料の使い道によって、数十 mm までスケールアップすることが可能である。内径が細いものが分析用、太いものが分取用。


移動相

一般に、逆相 HPLC の移動相には有機溶媒系と水系の混合溶液が用いられる (2)。

> 水系の移動相の割合が増えるなどして、溶離液の極性が上がったらどうなるか?
  • 試料の疎水性部が反発を受けて、カラムのオクタデシル基と強く密着するようになる (2)。
  • すなわち、系全体の疎水性部の表面積を小さくする方向に働く。
  • その結果、試料の保持時間は長くなる。

アセトニトリル

カラム圧や UV 吸収が低い (2)。最も汎用的で便利な有機溶媒と言える。

メタノール

アセトニトリルよりもカラム圧が上がり、かつ UV を吸収してしまうが安価 (2)。

テトラヒドロフラン

溶出力は大きいが、PEEK 樹脂を膨潤させる。試料が溶出しないときや、分離パターンを変えたいときに用いる。 (2)。

イソプロパノール

溶出力は大きいが、カラム圧が高い (2)。試料が溶出しないときや、分離パターンを変えたいときに用いる。


移動相の pH が変わると、溶質の構造が変わって溶出時間も変化する。溶質が電離する -OH 基を含む場合などには特に影響が大きい。そのため、移動相には緩衝液を加え、pH を一定に保つのが一般的である。


広告

順相 HPLC

順相 HPLC では、C18 基をつけないシリカゲルそのものなどが充填剤として使われる (5)。原理はシリカを使った TLC と同じで、シリカとサンプルが電気的に相互作用する。

逆相では、アセトニトリル、メタノールなど極性の高い溶媒を使うが、順相ではヘキサンなど極性の低い溶媒を使う。


広告

コメント欄

フォーラムを作ったので、各ページにあるコメント欄のうち、コメントがついていないものは順次消していきます。今後はフォーラムをご利用下さい。管理人に直接質問したい場合は、下のバナーからブログへ移動してコメントをお願いします。


References

  1. Amazon link: ストライヤー生化学: 使っているのは英語の 6 版ですが、日本語の 7 版を紹介しています。参考書のページ にレビューがあります。
  2. 一般財団法人化学物質評価研究機構 クロマト技術部. これでレベルアップ 逆相 HPLC におけるメソッド開発に役立つノウハウとトラブルシューティングの解説. Web (pdf).
  3. 逆相カラムの上手な使い方. Link: Last access 2018/05/05.
  4. 理論段数とは? 島津 HP. Link: Last access 2018/05/05.
  5. 第3部:逆相・順相、HILIC、イオン交換等のカラム. Link: Last access 2018/05/05.
  6. カラム内径の特徴と選択. Link: Last access 2018/05/08.
  7. By GYassineMrabetTalkThis vector image was created with Inkscape. - Own work, CC BY 3.0, Link